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氨基酸分析法对蛋白定量的初步分析

作者:2016-08-18 13:51文章来源:未知
  近年来,生物技术药物发展迅速,在疾病的预防、诊断及治疗中发挥着重要作用,而重组蛋白类药物在生物技术药物中占有较大比重。蛋白质含量测定是重组蛋白类药物质量控制中的重要指标之一,准确的蛋白质含量测定对产品的分装、比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定均具有重要意义。而蛋白含量测定标准品作为蛋白含量测定中的“标准”或“尺子”,其本身的准确定量十分重要。
  现行的蛋白含量测定国家标准品用于Lowry法或其他方法测定蛋白含量,其按《中国药典》三部(2010版)、WHO、ICH标准品有关要求进行制备、分装、冻干、质量检测,并开展了协作标定。该标准品经检定,分装精度(分装误差<1%)、外观、无菌、水分(0.7%)均符合要求,并经多家实验室进行凯氏定氮协作标定,结果为19.83mg/支。氨基酸分析是通过强酸或强碱破坏蛋白质中的肽键,进而使蛋白质水解为氨基酸的过程。再通过对组成蛋白质的各个氨基酸的分析进而实现对蛋白质的组成或定量分析。国外已有实验室应用氨基酸分析的方法对标准物质进行定量,本实验旨在利用氨基酸分析的方法对蛋白含量测定国家标准品进行蛋白含量测定,并与凯氏定氮的结果进行比较,以探讨氨基酸分析的方法用于该标准品或直接对其他重组蛋白定量的可行性。
  1材料与方法
  1.1标准品蛋白含量国家标准品,批号:(2005)国生标字0009,为本室保存。
  1.2主要试剂及仪器17种氨基酸标准溶液购自日本Ajinomoto公司;其他常用试剂均为国产分析纯;L8800型氨基酸分析仪购自日本Hitachi公司;旋转蒸发仪(型号为RE-52AA)购自上海亚荣生化仪器厂。
  1.3氨基酸组成分析
  1.3.117种氨基酸标准溶液的配制取标准溶液2ml,用0.02mol/L的盐酸稀释,容量瓶定容至50ml。将配制好的溶液作为样品氨基酸组成分析的标准溶液,在进样的20μl中含脯氨酸4nmol,其他16种氨基酸2nmol。
  1.3.2系统的适用性验证色谱条件:用L8800型氨基酸组成分析仪进行分析,交换柱为46mm×60mm,填料为3m的磺酸型阳离子交换树脂;柱温:57℃,反应器温度:135℃,柠檬酸钠缓冲液梯度洗脱,流速:0.4ml/min。各流动相的配制及洗脱程序均按照氨基酸分析的标准程序进行。取上述配制好的标准溶液,每针进样20μl,连续进样3针,计算各组分峰面积及保留时间的相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD),考察系统的稳定性。
  1.3.3蛋白含量国家标准品最佳水解时间的考察分别精密称取蛋白含量国家标准品5.4、5.1、5.7、5.7mg,加入氨基酸水解管中,加入6mol/L的盐酸溶液5ml,充氮,密封。在110℃条件下分别水解16、20、24、28h。水解后的样品全部转移至旋转蒸发仪进行旋蒸,干燥后的样品精确加入5ml水溶解,过0.45μm滤膜后上机备用。按照1.3.2项方法进行氨基酸组成分析,并计算回收率,考察蛋白含量国家标准品的最佳水解时间。
  1.3.4蛋白含量国家标准品的氨基酸组成分析取蛋白含量国家标准品7支,从每一支标准品中精密量取人血白蛋白(humanserumalbumin,HSA)约5mg,分别加入氨基酸水解管中,加入6mol/L的盐酸溶液5ml,充氮,密封。在110℃条件下,按照1.3.3项中确定的最佳水解时间进行水解。水解后的样品全部转移至旋转蒸发仪进行旋蒸。干燥后的样品精确加入5ml水溶解,过0.45μm滤膜后上机备用。按照1.3.2项方法进行氨基酸组成分析,样品每针进样10μl。并计算RSD、变异系数(CV)及回收率,验证方法的精密性及准确性。
  1.3.5数据处理将机器自动分析得到的各氨基酸含量(即10μl样品中含有的ng数)按照样品浓度转化为100mg样品中的mg数(如精密称量的样品质量为5.1mg,干燥后精确加入5ml水溶解,则样品浓度为:5.1mg/5ml=102mg/100ml,氨基酸分析测得的天门冬氨酸为939.64ng/10μl,则样品中天门冬氨酸含量为8.70mg/100mg)。通过对7支样品的测定,得到每种氨基酸测得结果的平均值,对测得的17种氨基酸的量进行加和,即可算出100mg样品中测得的样品mg数,进而计算出氨基酸分析仪测得的蛋白含量为实际称量的蛋白含量的百分数。另取蛋白含量国家标准品5支,按《中国药典》三部(2010版)“装量差异”法要求,计算其平均装量,与上述氨基酸分析得到的百分数相乘,即为蛋白含量值。
  2结果
  2.1系统的适用性试验结果显示,连续进样3针系统对各氨基酸组分均有良好的分离,其中各组分峰面积的RSD均小于1.5%,保留时间的RSD均小于1%,Thr-Ser、Gly-Ala和Ile-Leu均得到较好的分离,见图1。表明色谱分离条件合适,系统稳定性良好,可满足分析的需要。
  2.2蛋白含量国家标准品的最佳水解时间由于蛋白质样品在酸水解过程中会不同程度地造成氨基酸的水解破坏,理论上推测该方法测得的蛋白含量应小于实际称量的蛋白量,因此,排除与100%最为接近的20h水解样品得到的102.75%,选择结果为96.55%的水解样品的水解时间24h。
  2.3蛋白含量国家标准品的氨基酸组成分析经计算,蛋白含量国家标准品样品的含量值为(95.02±3.99)mg/100mg,RSD为4.20%。7次测定中,各氨基酸含量测定值的CV均小于1%。标准品中各氨基酸的回收率在93.56%~105.12%之间。5支蛋白含量国家标准品平均装量为0.0216g,即21.6mg,推算出国家标准品中白蛋白含量为20.52mg,与现行的凯氏定氮标定值(19.83mg)相比偏高,为其测定值的103.48%。
  3讨论
  质量控制的重要原则之一是能够进行量值溯源,标准品的准确定量是其中最重要的环节。本研究中蛋白含量国家标准品的原料为HSA,是通过对健康人血浆采用低温乙醇蛋白分离法或其他方法制备的,在制成标准品时,仅添加了磷酸盐,因此其适合进行氨基酸分析,而无干扰。在数据处理过程中,采用称重法将氨基酸分析法测得的蛋白含量值最终溯源到砝码上,主要是由于该标准品为白蛋白纯品,添加的微量磷酸盐可忽略不计,称量所得质量与实际质量应相符,实际称量值可对测得值进行验证,保证了测得结果的准确性。
  对蛋白质进行氨基酸分析,首先要将其肽键断裂(水解)形成游离氨基酸。水解过程中,Asn变成Asp,Gln变成Glu。本实验采用的是氨基酸分析仪,其原理是茚三酮柱后衍生法,即水解后的游离氨基酸经阳离子交换色谱柱分离后,与茚三酮反应,其中Pro与茚三酮反应产生黄色产物,在440nm处检测该产物,其他氨基酸与茚三酮反应则生成蓝紫色产物,在570nm处进行检测。通过分离得到的各氨基酸的峰面积与标准品中对应氨基酸峰面积进行比较,实现对各氨基酸的定量。在实际应用中,也可应用特定的试剂盒,结合高效液相色谱法进行氨基酸分析,避免了专一设备昂贵,不易于推广的缺点。氨基酸分析进行蛋白质定量具有以下优势:首先,凯氏定氮样品需求量较大,在一定程度上限制了该方法的应用,而氨基酸分析的方法自动化程度高,重复性好,所需样品量少,对于较难获得或样品量不大的标准品适于用氨基酸分析法定量;其次,目前广泛采用的Lowry、BCA、Bradford等方法均是与蛋白中的特定氨基酸或特定基团反应,各种蛋白其氨基酸组成不同,必定对检测结果产生影响。另外,标准品不同质也会产生误差,而氨基酸分析是对不同蛋白的个性化分析,可避免上述缺点;再次,随着生物技术的不断发展,新的、复杂蛋白不断出现,糖基化、PEG化引起的蛋白结构变化使原有的含量测定方法不适用,而氨基酸分析不受结构的影响,具有一定的优势。
  本研究将氨基酸分析法得到的定量值与凯氏定氮值进行比较,以考察氨基酸分析定量方法的准确性,结果表明,两者无明显差异,初步表明本研究所采用的氨基酸分析方法对现行蛋白含量国家标准品的蛋白含量测定准确,但还需进行更进一步的研究。
 

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