Hi:欢迎来到中国论文网     

所有论文科目分类

中国论文网 > 免费论文 > 医学论文 > 临床医学 >

剖析重组2 型腺相关病毒肿瘤坏死因子的质量

作者:2015-08-07 13:57文章来源:未知

  一直以来恶性肿瘤的治疗方法均是基础及应用研究聚焦的重点,放疗、化疗和手术治疗三大传统的治疗方法均有其不可忽视的局限性。因此,寻找具有生物活性的特异性的细胞毒性分子,选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,已成为当今肿瘤生物治疗领域的一个研究方向。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-induced Ligand,TRAIL)又称凋亡素2 配体(Apo2 ligand,Apo-2L),是可诱导肿瘤细胞凋亡的肿瘤坏死因子家族成员,其最大的特点是可选择性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无毒副作用。TRAIL 有5 种受体,分别为死亡受体4(death receptor 4,DR4)、死亡受体5(DR5)、诱骗受体1(decoy receptor 1,DcR1)、诱骗受体2(DcR2)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG),5 种受体的同源性较高,均可与TRAIL 发生特异性结合而不与其他配体结合。目前,国内已有数家企业开展针对TRAIL的重组蛋白药物和基因治疗制剂的研发。与重组蛋白药物相比,基因治疗的主要优势在于外源基因的稳定持续表达。本实验的研究对象为重组2 型腺相关病毒TRAIL(recombinant adeno-associated virus 2 encodingTRAIL,rAAV2-TRAIL),该制剂是将携带TRAIL 的质粒转染BHK-21 细胞,然后在辅助病毒1 型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV1)的作用下包装获得。为保证该类制剂的安全、有效和质量可控,本实验依据《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010 版)相关要求,结合该产品的特点,针对其结构、表达量、生物学活性、病毒颗粒数等关键质量属性开展研究,建立相应的质控方法,为质量标准的拟定提供数据支持。

  1 材料与方法

  1. 1 供试品及对照品

  rAAV2-TRAIL 基因治疗制剂、理化对照品均由委托质量研究的生产单位提供。

  1. 2 细胞、病毒及质粒

  293T 细胞、神经胶质瘤U251细胞和腺病毒(Ad5)均来自ATCC;阳性标准质粒pAM / CAG-TRAIL-neo、pSub201 和pHyTK(均按照1 × 109 copies / μl 冻存备用)由委托质量研究的生产单位提供。

  1. 3 主要试剂及仪器

  PBS(pH 7. 4)、0. 25%胰酶、MEM-EBSS 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清和青链霉素均购自美国Gibco 公司;CCK-8 染色试剂购自日本同仁化学研究所;DMSO、蛋白酶K、酚、氯仿等化学试剂购自美国Sigma 公司;TRAIL 蛋白浓度测定ELISA 试剂盒购自美国R&D 公司;3 mol / L NaAc及PCR 相关试剂购自日本TaKaRa 公司;SpectraMAX 250 型酶标仪及分析软件由美国MolecularDevices 公司提供;7500Fast 实时荧光定量PCR 仪、9700PCR 仪由美国ABI 提供。

  1. 4 重组基因结构的鉴定

  根据供试品基因组DNA的结构特性,采用PCR 法分别对启动子CAG 和插入的目的基因TRAIL 进行分析。将供试品煮沸10 min后,冰上冷却2 ~ 3 min,作为PCR 模板。CAG 鉴别:上游引物:5′-TGA CGT CAA TGG GTG GAG TA-3′,下游引物:5′-ATG GGG AGA GTG AAG CAG AA-3′,扩增片段大小为230 bp;反应条件为:94 ℃变性5 min;94 ℃变性45 s,55 ℃复性45 s,72 ℃延伸45 s,共30 个循环;72 ℃延伸7 min。TRAIL 鉴别:上游引物:5′-ATG GCC CTG TGG ATG CGC CTC-3′,下游引物:5′-TTA GCC AAC TAA AAA GGC C-3′,扩增片段大小为650 bp;反应条件同上。引物由Invitrogen 公司合成。PCR 产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以灭菌纯水代替模板同步反应作为阴性对照,同时将理化对照品与待测样品同步处理作对照。

  1. 5 目的蛋白TRAIL 表达量的检测

  取对数生长期的293T 细胞,用含10% FBS 的DMEM 完全培养液制备细胞悬液,每孔按2 × 105 个/ 2 ml 接种6 孔板,37 ℃, 5% CO2 条件下培养至细胞完全贴壁(至少12 h)。取2 孔进行细胞计数。弃培养上清,加入900 μl 37 ℃预热的无血清DMEM 培养基,按照MOI =2 × 105 缓慢接种rAAV2-TRAIL 病毒悬液,同时按MOI = 50 加入Ad5 悬液。对照孔仅接种同数量的腺病毒(Ad)。将培养板置含37 ℃,5% CO2 细胞培养箱中培养4 h;吸弃浸染液,加入预热的完全培养基,1. 5 ml / 孔,继续培养48 h;收集上清置1. 5 ml 离心管中,4 ℃,600 × g 离心5 min,收集上清。采用TRAIL蛋白浓度测定ELISA 试剂盒,将TRAIL 标准品稀释至1 000、500、250、125、62. 5、31. 2 和15. 6 pg / ml,作直线回归,检测上清中TRAIL 表达量,具体操作按试剂盒说明书进行。试验重复3 次。

  1. 6 生物学活性测定

  取对数生长期的神经胶质瘤U251 细胞,用含10% FBS 的MEM-EBSS 完全培养基制备细胞悬液,按每孔2. 5 × 103 个/ 0. 1 ml 接种96 孔板,37 ℃, 5% CO2 条件下培养24 h。取2 孔进行细胞计数。弃培养上清,将细胞孔分为2 组,每组3 ~ 5 个平行孔:阴性对照组,按照MOI = 50 加入Ad5;实验组:除加入等量的Ad5 外,按照MOI =2 × 105 加入rAAV2-TRAIL。用37 ℃预热的无血清MEM-EBSS 培养基补足至每孔100 μl,混匀后,置37 ℃,5% CO2 条件下培养4 h;弃上清,更换完全培养基,100 μl / 孔,继续培养72 h;弃上清,加入完全培养基(含有10 μl CCK-8 染色试剂),100 μl / 孔,反应1 h 后,于酶标仪450 nm 测定波长、630 nm 参考波长处测定A 值,并按下式计算细胞生长相对抑制率。试验重复3 次。细胞生长相对抑制率(%)=(1 - 实验组A450 / 对照组A450)× 100%。

  1. 7 rAAV2-TRAIL 滴度的检测

  采用Q-PCR 法。经饱和酚-氯仿法抽提样品中DNA,用灭菌纯水稀释1 000 倍后作为检测模板。用灭菌纯水将阳性标准质粒pAM / CAG-TRAIL-neo 稀释至1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103 copies / μl,用于绘制标准曲线。上游引物:5′ -GTT GCC AGC CAT CTG TTGTTT-3′,下游引物:5′-GCG ATG CAA TTT CCT CATTTT AT-3′,探针:5′-(FAM)GGT GCC ACT CCC ACTGTC CTT TCC(BHQ1)-3′。引物由Invitrogen 公司合成。反应条件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s(收集荧光),共40 个循环。用ABI 7500fast 的软件,以阳性标准质粒浓度的对数值为X 轴,对应的扩增CT 值为Y 轴进行直线回归,根据供试品的CT 值计算样品中rAAV2-TRAIL 拷贝数。试验重复3 次。

  1. 8 rcAAV 滴度的检测

  采用Q-PCR 法。经饱和酚-氯仿法抽提样品中DNA,用灭菌纯水稀释10 倍后作为检测模板。用灭菌纯水将阳性标准质粒pSub201 稀释至1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 ×102 copies / μl,用于绘制标准曲线。上游引物:5′-GAG CCG ACT TTG CCA AAC TG-3′,下游引物:5′-GGG AGC AAG TAA TTG GGG ATG TA-3′,探针:5′ -(FAM)TCC ACC ACC TTG TTC CCG CCT CCG(Eclipse)-3′。引物由Invitrogen 公司合成。反应条件同1. 7 项。用ABI 7500fast 的软件,以阳性标准质粒浓度的对数值为X 轴,对应的扩增CT 值为Y 轴进行直线回归,根据供试品的CT 值计算样品中rcAAV拷贝数,并计算rAAV2-TRAIL / rcAAV 比值,即相当于多少个rAAV2-TRAIL 中可检出1 个rcAAV。试验重复3 次。

  1. 9 辅助病毒HSV1 滴度的检测

  采用Q-PCR 法。经饱和酚-氯仿法抽提样品中DNA,以灭菌纯水稀释100 倍后作为检测模板。用灭菌纯水将阳性标准质粒pHyTK 稀释至1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102 copies / μl,用于绘制标准曲线。上游引物: 5′-CCT CAT CTT CGA CCG CCA TC-3′,下游引物:5′-GGT CAT GCT GCC CAT AAG GTA-3′,探针: 5′-(FAM)TCG CCG CCC TCC TGT GCT ACC C(Eclipse)-3′。引物由Invitrogen 公司合成。反应条件同1. 7 项。用ABI 7500fast 的软件,以阳性标准质粒浓度的对数值为X 轴,对应的扩增CT 值为Y 轴进行直线回归,根据供试品的CT 值计算样品中HSV1 拷贝数,并计算rAAV2-TRAIL / HSV1 比值,即相当于多少个rAAV2-TRAIL 中可检出1 个HSV1。试验重复3 次。

  2 结果

  2. 1 重组基因结构鉴定

  经1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析,CAG 基因扩增产物可见230 bp 的特异性条带,TRAIL 基因扩增产物可见650 bp 的特异性条带,均与预期及理化对照品相符。

  2. 2 目的蛋白TRAIL 的表达量检测

  结果显示,TRAIL 的表达量为(0. 36 ± 0. 18) ng / ml,RSD 为50. 0%。

  2. 3 生物学活性检测

  结果显示,细胞生长相对抑制率为(26. 6 ± 3. 75)%,RSD 为14. 1%,表明供试品对所选择的肿瘤细胞具有抑制和杀伤作用。

  2. 4 rAAV2-TRAIL 滴度检测

  结果显示,rAAV2-TRAIL 滴度为(4. 72 × 1011 ± 0. 52 × 1011)copies / ml,RSD 为11. 0%。

  2. 5 rcAAV 滴度检测

  结果显示,rcAAV 滴度为(2. 49 × 107 ± 0. 18 × 107)copies / ml,RSD 为7. 2%。rAAV2-TRAIL / rcAAV 为1. 90 × 104,相当于1. 90 ×104 个rAAV2-TRAIL 中可检出1 个rcAAV。

  2. 6 辅助病毒HSV1 的滴度检测

  结果显示,HSV1滴度为(6. 02 × 106 ± 0. 51 × 106)copies / ml,RSD 为8. 5%。rAAV2-TRAIL / HSV1 为7. 84 × 104,相当于7. 84 × 104 个rAAV2-TRAIL 中可检出1 个HSV1。

  3 讨论

  腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)因其安全性好、免疫原性弱、宿主范围广、能长期稳定地表达外源基因等优势而作为基因治疗用载体被广泛应用。特别是2012 年11 月,以1 型AAV 为载体表达脂蛋白脂酶的药物Glybera 被欧盟正式批准上市,AAV 在基因治疗领域获得了巨大成功。近年来采用AAV 载体的临床研究方案获准增长较快,目前世界范围内已完成或正在进行的rAAV 基因药物临床研究近120 项。我国的研发机构也应用AAV载体开展血友病、罕见病和恶性肿瘤治疗的相关研究。对于这一类结构复杂,功能各异的基因治疗药,关键质量属性研究在其由实验室研发到临床应用的成果转化中发挥着不可替代的作用。

  与一般的重组蛋白药物不同,基因治疗药物应对其基因进行结构鉴定。由于AAV 为单链DNA 病毒,不适合进行限制性酶切图谱鉴定,因此,本实验针对AAV 基因组中插入的启动子CAG 和目的基因TRAIL 进行鉴定,扩增结果与理论预期和理化标准品一致。对于Ad、HSV 等双链DNA 病毒载体的基因治疗药物,还应进行限制性酶切图谱鉴定。

  基因治疗药物的体外药效测定是评价其有效性的关键指标。一般而言,将重组病毒感染细胞并培养一定时间后,可通过Western blot 定性试验或ELISA等定量试验检测培养上清中目的蛋白的表达。同时可收集含目的蛋白的培养上清作用于合适的细胞系,以检测其生物学活性。如果培养上清中目的蛋白表达量较低,检测目的蛋白生物学活性存在困难,也可选择合适的细胞系,以重组病毒直接作用后,通过检测细胞增殖或凋亡评价其生物学活性。本实验中,将rAAV2-TRAIL 感染293T 细胞后,采用ELISA 法检测了培养上清中TRAIL 的表达量,证实目的基因获得有效表达,但表达量较低且实验间变异较大,这与AAV 载体体外表达量较低的特点有关。在生物学活性测定中,为验证供试品是否具有抗肿瘤作用,选择神经胶质瘤U251 细胞,以rAAV2-TRAIL 直接作用,证明供试品可抑制肿瘤细胞生长,证实了其体外抗肿瘤活性。

  对于rAAV2-TRAIL、rcAAV 和HSV1 的基因拷贝数检测,本实验采用Q-PCR 方法,不仅可实现相关指标的定量,还具有较高的灵敏度,且重复性好,对于严格控制制品中rcAAV 和HSV1 的含量,保证制品的安全性具有重要意义。

  除了本实验中提及的关键检测项目外,为保证制品的安全、有效和质量可控,还应对其无菌、支原体、外观、pH、纯度、残余DNA、残余牛血清白蛋白、残余宿主细胞蛋白、残余PEG、异常毒性等常规项目进行检定。

  综上所述,根据我国《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010 版)的相关要求,本实验针对rAAV2-TRAIL 的关键质量属性建立了质控方法,为该制品质量标准的建立和完善,以及保证其安全、有效、质量可控奠定了基础,同时也为类似产品的质量研究提供了参考。

最近相关

中国论文网

最新更新

热门推荐

[人文社科]英语广告语的特点与翻译原则
这是一篇关于英语广告语的特点与翻译原则的文章,掌握广告语的语言特点和翻译原则将有助于目标语读者了解产品功能,诠释...[全文]
[人文社科]基于跨文化的旅游英语翻译原则
这是一篇关于基于跨文化的旅游英语翻译原则的文章,跨文化视角下的旅游英语翻译,我们应尝试从读者的主观性理解以及本地...[全文]
[人文社科]中国传统节日中秋节的英译
这是一篇关于中国传统节日中秋节的英译的文章,中国传统文化的翻译,是随着时代变化而随之变化的。传统节日的中英翻译...[全文]
[人文社科]高职英语翻译教学中的问题与提升措施
这是一篇关于高职英语翻译教学中的问题与提升措施的文章,为了提升英语翻译教学的有效性,教师要不断地提升自身的综合素...[全文]
[理工论文]在现代城市建设中测绘工程中的作用
这是一篇关于在现代城市建设中测绘工程中的作用的文章,要需不断对测绘技术、测绘设备进行研究开发,不断革新,只有这样...[全文]
[理工论文]农业综合水利项目建设管理问题与解决措施
这是一篇关于农业综合水利项目建设管理问题与解决措施的文章,一定要提高设计人员对水利工程项目建设规划设计的重视度...[全文]

热门标签