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高强度聚焦超声对肿瘤细胞的杀伤力研究

作者:2016-08-04 11:43文章来源:未知

  高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)作为治疗肿瘤的一种手段,具有明确的聚焦靶点和消融效果,并对机体正常组织无损伤,已在临床上得到广泛应用。为了增强HIFU 治疗肿瘤的效果,提高HIFU 的超声强度是一种直接有效的途径,但此方法会增加超声路径上皮肤等正常组织受损伤的风险。而通过引入HIFU 增敏剂改变肿瘤局部组织的微环境,增强其对HIFU 治疗的敏感性,可以有效降低HIFU 治疗所需的超声强度阈值,并极大地增强肿瘤治疗的效果。本研究拟采用具有高生物相容性的脂质材料包载含有左旋薄荷醇的介孔二氧化硅纳米囊(mesoporoussilica nanocapsules,MSN),制备一种新型HIFU 增敏剂载介孔二氧化硅纳米囊脂质体(mesoporous silicananocapsules loaded liposomes,MSN-LIPO), 并在体外细胞培养条件下验证该增敏剂增强HIFU 杀伤力的作用,为下一步临床应用提供实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 仪器与试剂 二棕榈酰磷脂酰胆碱、生物素酞化聚乙二醇2000 修饰二硬脂酸磷酯酰乙醇胺(DSPEPEG2000-Biotin) 购于美国Avanti Polar Lipids 公司;胆固醇、FITC 标记的亲和素(avidin-FITC from eggwhite)购于美国Sigma-Aldrich 公司;MSN 受赠于中国科学院上海硅酸盐研究所;恶性胶质瘤细胞U87 MG购于美国ATCC 细胞库;DMEM 高糖培养基购于美国Hyclone 公司;胎牛血清购于以色列Biological Industries公司;青霉素/ 链霉素和胰酶购于美国GIBCO 公司;cell counting ki(t CCK-8)试剂购于日本同仁(DOJINDO)公司;流式细胞凋亡检测试剂(annexin V-FITCapoptosis kit)购于美国BioVision 公司;纳米粒度及电位分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS,英国);共聚焦激光显微镜(Leica TCS SP5,德国);多功能酶标仪(BioTek Synergy4,美国);分选型流式细胞仪(BDAccuri C6,美国);HIFU 治疗机(惠康,中国)。

  1.2 MSN-LIPO 的制备和表征 将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2000-Biotin 按55∶40∶5 的摩尔比溶解于三氯甲烷中,在氮气流的作用下涡旋蒸发有机溶剂,形成均匀脂质膜,然后在真空条件下干燥处理2~4 h。在干燥脂质膜中加入1 ml 二氧化硅纳米囊溶液,于65℃水浴超声清洗机中声振处理至脂质溶液澄清。取适量制备好的脂质体溶液于纳米粒度及电位分析仪中测量粒径大小和Zeta 电位,并取适量样本干燥处理后进行透射电子显微镜成像,观察颗粒内部结构。

  1.3 MSN-LIPO 的生物相容性 采用DMEM 高糖培养基(DMEM+10% 胎牛血清+1% 青霉素/ 链霉素)培养U87 MG 恶性胶质瘤细胞,置于37℃、5% CO2浓度的细胞培养箱中。取对数生长期1×104 个细胞接种于细胞培养板中,在细胞培养箱中培养24 h。将脂质浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/ml 含MSN-LIPO培养基加入细胞培养板中孵育24 h,随后加入适量CCK-8 试剂,约2 h 后于多功能酶标仪中测量OD 值。

  1.4 U87 MG 恶性胶质瘤细胞对MSN-LIPO 的摄取 取适量 FITC 标记的亲和素加入MSN-LIPO 溶液中,通过生物素- 亲和素反应,将FITC 标记到MSN-LIPO表面。配制成0.1 mg/ml FITC-MSN-LIPO 的DMEM 培养基,加入U87 MG 细胞培养板中,分别孵育0 min、15 min、30 min、1 h、2 h,用PBS 洗去本底,于共聚焦激光显微镜下观察U87 MG 细胞对FITC-MSN-LIPO的摄取情况。采用Image J 软件对不同分组的细胞荧光强度进行定量分析,比较各组细胞摄取差异。

  1.5 MSN-LIPO 增强HIFU 杀伤效力的评价 分别设立对照组、MSN-LIPO 组、HIFU 组和HIFU+MSN-LIPO组。对照组U87 MG 细胞培养未经任何处理,MSNLIPO组使用脂质浓度为1.0 mg/ml 的培养基孵育2 h,HIFU 组U87 MG 细胞培养接受40 V、1 min 的HIFU参数辐照,HIFU+MSN-LIPO 组在MSN-LIPO 孵育2 h后再接受相同参数的HIFU 辐照。取各组样本经annexinV-FITC apoptosis 试剂的碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色处理后,于分选型流式细胞仪中检测细胞坏死情况。

  1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件,采用单因素方差分析比较不同浓度分组MSN-LIPO 对U87 MG 细胞毒性作用的组间差异、不同孵育时间分组U87 MG细胞荧光强度的组间差异及不同治疗分组细胞坏死情况的组间差异,两两比较采用SNK-q 检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 MSN-LIPO 的基本表征 采用薄膜水化法制备的MSN-LIPO 悬液均匀透亮,纳米粒度及电位分析仪检测结果表明,MSN-LIPO 的粒径大小约为(128.60±2.11)nm,呈单峰正态分布(图2A),Zeta 电位约为(- 22.90±0.77)mV,具有良好的稳定性。透射电子显微镜图显示MSN-LIPO 粒径大小与纳米粒度及电位分析仪测得结果一致,圆形脂质体内部的点状颗粒即MSN。

  2.2 MSN-LIPO 的生物相容性评估 不同浓度的MSN-LIPO 均未表现出对U87 MG 细胞的显著毒性作用,浓度达到1.0 mg/ml 时,剩余细胞活性仍然高达90% 以上。对各组OD 值进行单因素方差分析,组间差异无统计学意义(F=1.56,P>0.05), 表明MSN-LIPO 具有良好的生物相容性。

  2.3 U87 MG 细胞对MSN-LIPO 的摄取 共聚焦激光显微镜显示,孵育时间为0 min 时,未见FITC-MSNLIPO的绿色荧光;孵育时间为15 min 时,可以观察到靠近细胞膜部位不连续的点状绿色荧光;随着摄取时间延长,细胞质内绿色荧光逐渐增多,具有良好的时间依赖性。采用Image J 图像处理软件对各组细胞荧光强度进行定量比较,单因素方差分析结果显示,组间差异有统计学意义(F=675.81,P<0.05);两两比较显示,15 min 组与0 min 组相比,摄取增加(q=8.90,P<0.05);30 min 组与15 min 组相比,摄取增加(q=2.43,P<0.05);1 h 组与30 min 组相比,摄取增加(q=19.77,P<0.05);2 h 组与1 h 组相比, 摄取增加(q=14.05,P<0.05)。

  2.4 MSN-LIPO 增强HIFU 杀伤效力的评价 纵坐标为侧向角散射,横坐标为细胞PI 染色荧光信号强度,结果显示对照组和MSN-LIPO 组的细胞群落均集中在Q4 区域;HIFU 组与对照组相比,部分细胞分布开始沿横坐标方向往Q3区域右移;而HIFU+MSN-LIPO 组细胞分布右移更为明显,在Q3 区域形成细胞群落,表明更多的PI 染料进入细胞内,受损细胞数目增多。单因素方差分析结果显示,组间差异有统计学意义(F=713.52,P<0.05);两两比较显示,MSN-LIPO 组与对照组相比,差异无统计学意义(q=0.01,P>0.05),表明单纯MSN-LIPO对细胞没有杀伤作用;HIFU 组与对照组相比,坏死细胞数目增多,差异有统计学意义(q=15.58,P<0.05);HIFU+LIPO 组与对照组相比,坏死细胞数目增多,差异有统计学意义(q=39.99,P<0.05);HIFU+LIPO 组与单纯HIFU 组相比,坏死细胞数目增多,差异有统计学意义(q=24.40,P<0.05),表明MSN-LIPO 可以促进HIFU 对肿瘤细胞的杀伤作用。

  3 讨论

  HIFU 治疗肿瘤的生物学机制主要包括热效应和机械效应:当聚焦部位的肿瘤组织在HIFU 的作用下,温度升高达55~60℃以上时,组织会发生凝固性坏死;组织中的微小气泡在声场的运动中会产生惯性和非惯性空化效应,在剪切力、微射流、冲击波等作用下,HIFU 起到机械解体肿瘤组织的作用。针对HIFU治疗的机械效应,本研究引入一种固、液、气三相转换的具有温和促空化作用的左旋薄荷醇作为HIFU 增敏剂内核,左旋薄荷醇被包载于MSN 内部,然后用脂质材料包裹MSN, 形成一种全新的HIFU 增敏剂MSN-LIPO。MSN-LIPO 内部的左旋薄荷醇具有强挥发性,特别是处于液态时更易挥发,在HIFU 的作用下,左旋薄荷醇会持续地由固、液相向气相转换,形成微泡样结构,改变靶点区域声特性,增强HIFU 的杀伤效力。

  既往研究中,超声微泡常用作HIFU 增敏剂,但由于微泡的粒径多在微米级别,很难通过EPR 效应实现微泡在肿瘤组织内的富集,同时,微泡在体内稳定性差、存留时间短,使其在HIFU 治疗中的应用受到限制。为了克服微泡的粒径和稳定性等问题,HIFU联合纳米颗粒的研究逐渐增多。Zhou 等采用液气相转换的策略,制备了一种靶向纳米乳,外壳是生物相容性较好的脂质类材料,内核是沸点约为56℃的全氟己烷;外壳表面配有叶酸,增强纳米乳的主动靶向性。全氟己烷在HIFU 的作用下,发生液气相转换,形成微泡样结构,增强了靶点区域对HIFU 治疗的敏感性。然而,以氟碳化合物作为超声空化核心的纳米材料,空化过程非常迅速、猛烈,因而会产生一些安全性问题,特别是HIFU 聚焦在肿瘤边界时,强烈的空化效应可能会导致更多的正常组织受到损伤。本研究制备的的MSN-LIPO,其平均粒径大小约为128 nm,具有良好的被动靶向性,克服了微泡不能在肿瘤组织内长时间富集等缺点;空化核心选用左旋薄荷醇,通过固、液、气三相转换可以实现温和促进超声空化作用,避免既往研究中氟碳化合物强烈促空化作用可能导致的肿瘤边界过多的正常组织损伤。

  本研究中,细胞毒性实验表明,MSN-LIPO 表现出良好的生物相容性,在浓度高达1.0 mg/ml 时,仍未对细胞表现出显著毒性作用(F=1.56,P>0.05);得益于小粒径和脂质外壳,共聚焦激光显微镜图像显示MSN-LIPO 很容易被肿瘤细胞摄取,并随着时间延长,摄取量呈增加趋势,为治疗提供了良好的条件。在评价HIFU 联合MSN-LIPO 杀伤U87 MG 恶性胶质瘤细胞的实验中,单纯MSN-LIPO 组的细胞群落分布与对照组十分相似,对细胞无杀伤作用;HIFU 组和HIFU+MSN-LIPO 组细胞群落在横坐标方向均向右移动,显示出对肿瘤细胞的杀伤作用,其中HIFU+MSN-LIPO组右移更为明显,并形成第二细胞群落,表明在MSNLIPO的协同作用下,HIFU 机械效应损伤的细胞数目显著增加(q=24.40,P<0.05)。

  总之,本研究成功制备了一种新型HIFU 增敏剂MSN-LIPO,并在体外细胞培养水平证实了该复合物增强HIFU 杀伤力的协同增效作用。然而,MSN-LIPO在体内是否能在肿瘤部位蓄积及是否能够增强HIFU对在体实体瘤的杀伤作用尚未得到证实,因此,MSNLIPO在体内的实验研究亟需进行。

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