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试论“野菊花提取物”对糖尿病肾病大鼠的影响及作用机制

作者:2015-07-29 14:15文章来源:未知

  糖尿病肾病是糖尿病患者常见的严重的慢性微血管并发症之一,最终会导致肾衰竭[1]。糖尿病肾病的发病机制复杂,尚未完全阐明,糖脂代谢紊乱,活性氧、血管活性物质、遗传因素以及生长因子在其发生和发展过程中均起着重要作用。目前研究发现糖尿病患者体内醛糖还原酶(aldosereductase,AR)基因表达及酶活性均增强,AR 抑制剂能有效的降低血糖,故认为AR 可能作为多元醇通路的限速酶参与糖尿病慢性并发症的发生。中草药具有作用持久、缓和,不良反应小,从整体水平上防治慢性病等特点。随着中药现代化进程的发展,从价廉物美的传统中草药中筛选出对糖尿病肾病有防治作用的药物具有重要意义。野菊花为菊科植物野菊Chryanthemum indicum L.的干燥头状花序,味苦辛,性微寒,归肝、心经,清热解毒,是一种常用的中草药,在我国民间药用历史悠久。黄酮类化合物是其主要有效成分之一,包括蒙花苷、刺槐素、木犀草素、槲皮素等。据文献报道,这几种黄酮类化合物对醛糖还原酶有一定的抑制作用。但目前尚未见野菊花提取物与糖尿病慢性并发症之间的关系的报道,仅限间接推测野菊花提取物可延缓糖尿病慢性并发症的发生。本研究通过观察野菊花提取物对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用,并从抗氧化应激、调节肾脏AR 活性及其基因表达等方面初步探讨野菊花抗糖尿病大鼠肾损伤、保护肾功能的作用机制,为野菊花防治糖尿病肾损伤的临床应用提供的实验依据。

  1 材料

  1.1 动物

  SD 大鼠,♀,体质量160~180 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:SCXK(沪)2012-0002,饲养于浙江大学实验动物中心,使用许可证号:SYXK(浙)2012-0178,饲养环境温度22~26 ℃,湿度40%~70%,明暗交替各12 h,换气次数10~20 次·h1,实验动物自由饮水、摄食。

  1.2 药物与试剂

  链脲佐菌素(streptozotocin , STZ)购于美国Sigma 公司(批号:2014110);AR 酶联免疫试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司);总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(批号:20141219)、过氧化氢酶(catalase,CAT)(批号:20140813)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)(批号:20140807)和考马斯亮蓝检测试剂盒(批号:20140723)均购自南京建成生物工程研究所;Trizol 试剂(Invitrogen 公司,批号:15596-026);RT-PCR 试剂盒(TaKaRa 公司,批号:9767);依帕司他(山东达因海洋生物制药股份有限公司,批号:130902,规格:50 mg)。野菊花药材产自安徽,由浙江医学高等专科学校生药学吴晓宁副教授鉴定为菊科植物野菊(Chrysanthemumindicum L.)的干燥头状花序(批号:131028)。

  1.3 仪器

  One-touch ultra ZSJ 843ETT 型血糖仪(强生);Cobas8000 全自动生化分析仪( 德国罗氏) ;EG1150H 包埋机、RM2235 石蜡切片机、HI1220烤片机、HI1210 摊片机、ASP300 脱水机、ST5010全自动染色机均购自Leica;BNprospec 特种蛋白分析仪(西门子)。

  2 方法

  2.1 野菊花提取物的制备

  野菊花药材粉碎,过60 目筛,加入溶剂乙醇,料液比为1∶100,浸泡30 min,加热至80 ℃回流2 h,提取3 次,合并提取液,浓缩得提取物浸膏,4 ℃冰箱保存。

  2.2 糖尿病肾病大鼠模型

  建立大鼠给予高脂饲料(48%碳水化合物,22%脂肪,20%蛋白质)喂养1 个月后经腹腔1 次性注射STZ(溶于0.1 mmol·L1 枸橼酸钠缓冲液中,pH4.5)35 mg·kg1,注射后连续3 d 检测空腹血糖、尿糖,连续3 d 血糖浓度>16.7 mmol·L1、尿糖定性++以上、尿量增加>1 倍以上为2 型糖尿病模型形成。继续喂养1 周,随机抽取2 只测尿微量白蛋白,蛋白浓度>15 μg·mL1,确定糖尿病肾病模型形成。

  2.3 分组与给药

  将造模成功的SD 大鼠,♀,随机分为模型对照组、野菊花提取物低、中、高剂量组、阳性药依帕司他组,每组8 只。野菊花提取物低、中、高剂量组分别给予野菊花提取物1,2,4 g·kg1,依帕司他组给予10 mg·kg1 依帕司他,正常对照组和模型对照组给予相应的生理盐水,各组均连续灌胃8 周。实验期间不应用胰岛素。

  2.4 指标检测

  于第8 周末称重,末次给药后禁食12 h,尾静脉取血测空腹血糖。放代谢笼收集24 h 尿液,测尿白蛋白。处死大鼠,取双侧肾脏称重,计算肾脏脏体比(肾脏质量/体质量)。一侧肾脏置于10%中性福尔马林液浸泡固定,供形态学检测;另一侧肾脏称重、匀浆,80 ℃保存,严格按照试剂盒说明书操作检测SOD、CAT 活性、MDA 含量及AR 活性。

  2.5 组织形态学检测

  固定后的肾脏用石蜡包埋,HE 染色,在光镜下观察肾组织形态学改变。由浙江大学实验动物中心专业病理人员阅片后出具报告。

  2.6 肾脏AR 活性检测

  取80~100 mg 肾脏,按l∶9 加入冰生理盐水制成组织匀浆液,1 500 r·min1 低温离心,离心10 min,上清即为组织匀浆液,整个样本处理过程均在4 ℃下进行。用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定组织样本中AR 浓度。

  2.7 RT-PCR 检测

  AR mRNA 表达用Trizol 试剂按说明书提取肾脏样本的总RNA,用RT-PCR 试剂盒进行逆转录和PCR 扩增反应,42 ℃逆转录60 min,94 ℃灭活逆转录酶3 min,94 ℃变性1 min,60 ℃复性1 min,72 ℃延伸2 min,共33 个循环,扩增产物长度670 bp。LAB-WORK 图像分析系统进行灰度扫描分析,AR与β-actin(内参照)灰度比值代表mRNA 表达的半定量值。AR 引物序列分别为:正向5’-ACTGCCATTGCAAAGGCATCGTGGT-3’;反向5’-CCCCCATAGGACTGGAGTTCTAAGC-3’。

  2.8 统计学处理

  采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。所有数据用 x  s 表示,组间差异性比较用单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

  3 结果

  3.1 野菊花提取物对大鼠体质量、血糖的影响实验前各组大鼠均无明显差异,造模后3 d 各组血糖均显著高于正常对照组(P<0.05)。给药8 周,与正常对照组比较,模型对照组大鼠血糖、肾脏脏体比、24 h 尿蛋白量显著升高(P<0.05 或0.01),体质量显著降低(P<0.05)。与模型组比较,野菊花提取物各治疗组体重升高,肾脏脏体比降低,血糖、24 h 尿蛋白量显著降低(P<0.05 或0.01)。

  3.2 野菊花提取物对大鼠肾脏SOD、CAT、MDA含量的影响与正常对照组比较,模型对照组大鼠肾组织中SOD 含量显著降低(P<0.05),MDA 含量显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,野菊花提取物各组大鼠肾组织SOD 活性显著升高,MDA 含量明显降低(P<0.05 或0.01)。

  3.3 野菊花提取物对大鼠肾组织形态学的影响光镜下可见正常对照组肾小球和肾小管组织结构正常。模型对照组肾小球毛细血管扩张,肾小球肥大,肾小球细胞数目减少,肾小管上皮细胞空泡或颗粒变性,少量上皮细胞坏死脱落。依帕司他组肾小球和肾小管组织结构正常。野菊花低剂量组肾小球毛细血管扩张,肾小球肥大,肾小球细胞数目减少。肾小管上皮细胞空泡或颗粒变性,少量上皮细胞坏死脱落。野菊花中剂量组肾小球和肾小管组织结构正常。野菊花高剂量组肾小球组织结构正常,肾小管轻微上皮细胞空泡,可能是口服高剂量野菊花提取物对大鼠肾脏有一定的影响,有待进一步研究。

  3.4 野菊花提取物对大鼠肾组织AR 活性及其mRNA 表达的影响与正常对照组比较,模型对照组肾组织AR 活性及其mRNA 的表达明显增强(P<0.05);与模型对照组比较,依帕司他和野菊花提取物高、中剂量明显降低肾组织AR 活性,下调AR mRNA 的表达(P<0.05)。

  4 讨论

  糖尿病肾病是糖尿病患者主要的死亡原因之一,其早期临床表现主要为尿中白蛋白增多,因此本实验以尿白蛋白显著增加为依据建立糖尿病肾病模型,给予野菊花提取物后,尿白蛋白显著下降,提示野菊花提取物对肾脏有一定的保护作用。

  糖尿病肾病的发病机制十分复杂,目前尚未阐明,可能是在遗传背景基础上多因素综合作用的结果。而越来越多的体内外实验证实,高血糖是其发病的重要原因。在糖尿病情况下,多元醇代谢通路激活,肾脏超氧化产物增加,导致抗氧化酶如SOD、CAT 等活性显著下降,表明其氧化应激水平上升,造成肾脏细胞损伤,促进了糖尿病肾病的发生、发展。本研究结果显示:模型大鼠肾功能明显受损,同时肾脏抗氧化酶SOD、CAT活性低下,脂质过氧化代谢产物MDA 含量增加。给予野菊花提取物治疗后,SOD、CAT 活性增强,同时MDA 含量减少,提示野菊花提取物可以减轻氧化应激损伤,对糖尿病肾病的发展有一定的延缓作用。本研究进一步探讨了野菊花提取物对多元醇代谢通路的作用机制。AR 是多元醇代谢通路中重要的关键限速酶,葡萄糖在AR 的催化作用下转化为山梨醇,继而再氧化成果糖。当血糖正常时,AR 活性低,它对葡萄糖的亲和力较低,此时葡萄糖很少转化为山梨醇。当血糖浓度升高时,磷酸己糖激酶被葡萄糖饱和,这时AR 活性增强,使得大量葡萄糖转化为山梨醇。然而山梨醇不易透过细胞膜,在细胞内大量积聚,造成细胞渗透性水肿,并破坏细胞膜结构的完整性,从而导致细胞代谢与功能的损害。因此肾组织AR活性的增强与糖尿病肾损伤的发生、发展关系密切。

  本研究结果显示:模型组大鼠AR 活性与基因表达明显升高,证实了糖尿病肾病与肾组织AR 活性增高以致多元醇通路激活密切相关。给予野菊花提取物治疗后,肾脏AR 活性降低,AR mRNA水平下调,提示野菊花提取物可通过下调ARmRNA 水平来抑制AR 活性,从而抑制多元醇代谢通路的激活。

  总之,对于糖尿病肾病大鼠,野菊花可能通过有效降低血糖、提高机体抗氧化能力、减少肾脏AR 活性及其基因表达以抑制多元醇通路的激活来发挥其肾功能保护作用。

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