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详谈菝葜对TNBS 诱导的溃疡性结肠炎的影响

作者:2015-08-05 10:56文章来源:未知

  溃疡性结肠炎肠病(Ulcerative Colitis,UC)具有慢性、反复发作的临床特点,发病机制尚不完全清楚,可能与基因易感性、环境、肠粘膜免疫反应异常有关。目前没有特异性的治疗药物,因此通过建立结肠炎动物模型发掘有效的治疗药物具有重要意义。菝葜为百合科植物菝葜Smilax china L. 的根茎,作为药用的记载,始载于《名医别录》,具有祛风利湿、解毒散瘀的功效,主要用于治疗妇科炎症,且效果良好,无明显副作用。动物实验也发现菝葜具有抗炎作用,但其抗炎作用在UC 中未见报道。本实验旨在研究菝葜水提取物在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导UC 大鼠实验模型中的疗效,探讨其可能的机制。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  健康SD 雄性大鼠 48 只,体质量200-220 g,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:4402102031,SPF 级饲养。TNBS(美国Sigma 公司,批号:C9801-25);兔抗NF-κB 多克隆抗体、鼠抗Actin 单克隆抗体(碧云天生物试剂有限公司,批号:AN365、AA128),兔抗TNF-α 多克隆抗体(武汉博士德生物公司,批号:BA14901);山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(美国Cell Signaling 试剂公司,批号:7074、7076);免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(福建迈新生物试剂有限公司,批号:KIT5010、DAB0031);大便隐血试剂盒[珠海贝索公司的贝索粪便隐血2 号试剂盒(Fecal OB- Ⅱ),批号:B04]。菝葜饮片(北京同仁堂,批号:090706),强的松(广东三才医药集团)。3K-30Z 型高速冷冻离心机(美国Sigma 公司),垂直电泳仪(GE 公司),半干式转膜仪、硝酸纤维素膜(Bio-Rad 公司),ECL 发光液(Millipore 公司)、Kodak 2000MM 柯达活体成像仪(Kodak 公司),Nikon Eoipse Ti-s 荧光显微镜(日本尼康公司)。

  1.2 方法

  1.2.1 药物制备

  菝葜饮片由南方医科大学中医药学院中药教研室陈兴兴老师鉴定为正品。取菝葜饮片研成粉末,煎煮两次(1:8,w/v),将两次滤液合并,过滤,文火浓缩成1 g·mL-1。结合成人临床使用量与大鼠折算的方法(大鼠使用量= 成人使用量×6.28),并参照Shu X S 等[2] 的给药方法制备药物。

  1.2.2 造模及给药

  SD 雄性大鼠48 只,随机分成对照组、模型组、菝葜组、强的松,每组12 只。建立TNBS 诱导大鼠UC 模型,造模前禁食24 h,自由饮水,10% 水合氯醛(0.35 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,将外径2 mm 的医用硅胶管轻缓插入大鼠肛门6-8 cm,用1 mL 注射器将1 mL TNBS/ 乙醇混合液经硅胶管缓慢推注于结肠,拔出导管,对照组用1 mL 生理盐水推注,大鼠仰卧,保持肛门高位,自然清醒,自由饮水、进食。造模24 h 后,菝葜组、强的松组分别按1 200 mg·kg-1、3 mg·kg-1(10 mL·kg-1)的浓度灌胃给药,每天1 次,连续1 周,模型组和对照组以等量生理盐水灌胃。

  1.2.3 一般情况及大便隐血观察

  观察大鼠在饲养过程中有无死亡、精神状态、活动情况、毛发光泽度、食欲、大便情况(血便、腹泻、大便次数增多等)及体质量改变,并进行疾病活动指数(Disease Activity Index,DAI)评分,DAI 评分标准见表1。DAI =(体质量下降分数+ 粪便性状分数+ 隐血分数)。大便性状正常是成形大便;稀便是糊便或者半成形大便但不黏附肛门;腹泻是水样便并且黏附肛门。处死大鼠前,从肛门挤一颗粪便至洁净塑料杯子,滴加2 mL 生理盐水溶解,取粪便检查试纸条插入粪便溶解液中,观察阳性结果(按说明书操作)。

  1.2.4 肠标本大体观及取材

  取下整段大肠(从肛门至盲肠),沿肠系膜纵向剪开,用冰生理盐水冲洗干净,普通拍照观察大鼠结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、出血点、充血等情况,组织学评分标准采用欧阳钦等评分方法:0 分:无损害;1 分:黏膜充血、水肿,未出现溃疡;2 分:黏膜充血、水肿,轻度糜烂,无溃疡;3 分:黏膜充血、水肿,中度糜烂,有单个溃疡;4 分:黏膜充血、水肿,重度糜烂,有多处溃疡;5 分:黏膜充血、水肿,重度糜烂,有>1 cm 溃疡;6-10 分:如果损伤范围>2cm,每增加1 cm,评分加1 分。取结肠部位2 cm,随机分成2 份,1 份用10% 甲醛固定,另一份冻存于-80℃。

  1.2.5 HE 染色病理观察

  常规石蜡包埋,连续切片4 μm,60℃烤片1 h,组织进行脱蜡、梯度酒精水化、苏木精复染、盐酸酒精分化、流水反蓝、伊红染色、自来水冲洗、梯度酒精脱水、透明、封片、镜检,应用Nikon Eoipse Ti-s显微镜观察,病变按以下标准进行分级。Ⅰ级:基本正常;Ⅱ级:中性粒细胞浸润,达黏膜层及黏膜固有层;Ⅲ级:中性粒细胞浸润达黏膜下层;Ⅳ级:隐窝脓肿,黏膜全层明显细胞浸润;Ⅴ级:糜烂、溃疡、黏膜坏死,黏膜全层明显细胞浸润。

  1.2.6 NF-κB 原位表达检测

  组织切片进行脱蜡、水化、柠檬酸钠抗原修复、3% 双氧水内源性封闭15 min、5%BSA 外源性封闭15 min、滴加NF-κB(1:200)一抗,4℃孵育过夜,PBS 洗涤3 次,每次5 min,滴加二抗,加生物素,DAB 显色,苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检,随机选取5 个高倍(×200)视野观察拍照,采用ipp6图片分析软件分析,读出每一张图的阳性结果的灰度值,灰度值的高低代表阳性的强弱。

  1.2.7 Western blotting 检测TNF-α、NF-κB 的表达

  结肠组织剪碎后,液氮研磨,加入Western 及IP细胞裂解液抽提蛋白,BCA 法蛋白定量,12% SDSPAGE,上样量60 μg。将胶上蛋白用半干转移法转印至PVDF 膜,5% 脱脂奶粉室温封闭1 h,孵育一抗:Actin(1:1 000 稀释)、TNF-α(1:500 稀释)、NF-κB(1:500 稀释)4℃孵育过夜,抗鼠、抗兔二抗(1:2 000稀释)常温孵育1 h,利用Kodak 2000 MM 图像工作站进行检测。图像用Molecular Imaging Software Version4.0(Kodak)进行蛋白条带灰度分析。每一个样品的灰度值与对应的样品内参Actin 比较,比值作为该样品相对蛋白的表达量。

  1.3 统计学方法

  应用Spss13.0 软件,数值用均数±标准差(x±s)表示,采用One-way ANOVA 分析,方差齐时,两组比较采用LSD;当方差不齐时,采用Welch 稳健估计,再采用T3 方法两两比较。P<0.05 有统计学意义。

  2 结果

  2.1 一般指标的观察及检测

  模型组大鼠造模后活动差,进食减少,腹泻,肛周毛粪染,黄色稀便伴血便,粪便可见少量鲜血,粪便隐血试验阳性,体质量较造模前下降,病变累及全部大结肠,呈节段性改变,出现肠壁增厚、肠腔狭窄、与周围组织粘连、可见粘膜充血水肿、糜烂,形成浅表大溃疡。强的松组、菝葜组大鼠造模后第1、2 天出现活动差,进食减少,之后活动较模型组活跃,便血大鼠比较少。

  2.2 菝葜对溃疡性大鼠直肠病理的影响

  镜下可见模型组糜烂、溃疡、黏膜坏死,黏膜全层明显细胞浸润,达到Ⅴ级损伤;强的松组和菝葜组与模型组比较,炎症细胞减少,中性粒细胞浸润达黏膜下层并出现溃疡,未出现糜烂达到Ⅲ - Ⅳ级损伤;菝葜组与强的松组效果相当。

  2.3 菝葜对NF-κB 原位表达的影响

  NF-κB 主要表达在结肠粘膜固有层浆细胞、单核细胞、中性粒细胞中,模型组中胞浆和胞核均可见NF-κB 的表达,与模型组比较,菝葜组和强的松组NF-κB 在胞核中的表达明显减少(P<0.01)。

  2.4 菝葜对TNF-α、NF-κB 表达的影响

  Western blotting 分析显示,TNF-α、NF-κB 与对应的Actin 的比值代表TNF-α、NF-κB 的表达量。与模型组相比,菝葜组TNF-α、NF-κB 的表达水平显著降低(P<0.01),与强的松组的表达相似,且与免疫组化结果相一致。

  3 讨论

  UC 是一种病因尚不明确的慢性肠道炎症性疾病,主要临床表现以反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便及里急后重为特征,属于中医“痢疾”、“滞下”、“肠癖”等范畴,治疗上多采用益气活血、清热利湿解毒之法。菝葜具有祛风利湿、解毒散瘀的功效,现代药理学研究表明,菝葜主要有效成分是黄酮类化合物,还含有酯类、甾醇类、茋类和矿物元素等,其中白藜芦醇是芪类的一种,具有明显的抗炎作用。本实验结果显示菝葜可以增强UC 大鼠的活动力,饮食增多,腹泻减少,粪便隐血试验阳性率少,体质量增加,病理病变明显改善,提示菝葜对UC 有一定的治疗作用。

  核因子(NF-κB)是一类能与多种基因启动子或增强子部位κB 位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质。一般状态下NF-κB 二聚体与一种被称为IκB的抑制蛋白结合形成三聚体,以无活性形式存在于细胞浆中,当细胞受到刺激时,IκB 激酶被磷酸化,IκK即从无活性状态转为活性状态,进而磷酸化IκB,磷酸化、泛酸化的IκB 再被26S 蛋白酶小体降解,受其抑制的NF-κB 得以释放,脱离NF-κB-IκB 三聚体,由胞质进入核内,与相应靶基因中的启动子或增强子κB 位点结合,诱导靶基因的转录,从而直接参与机体对炎症及免疫反应的调控。NF-κB 是UC 炎症级联放大效应及“瀑布样效应”的开关,NF-κB 可促进多种炎性细胞因子,如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等基因的转录,NF-κB 活化可能是UC 病理生理过程的枢纽。TNF-α 是一个比较重要的前炎症因子及抗肿瘤因子,TNF-α 激活的炎症反应主要通过2 个不同的跨膜受体即TNFR1 和TNFR2 来完成。其中TNFR1-TRADD 复合物能招募下游的NIK(NF-κB inducingkinase)信号分子,并通NF-κB 信号分子来开启下游的炎症反应和细胞凋亡。TNF-α 介导的炎症反应主要是通过激活NF-κB 的活性,NF-κB 被激活就会发生核转位进入细胞核中,进而介导相关细胞因子、趋化因子及黏附因子的产生,而TNF-α 又可再作用细胞介导炎症信号的表达,周而复始形成放大的炎症反应,加速病情的发展。因此,通过阻断TNF-α 介导的炎症反应,对治疗UC 具有重要的临床意义。实验结果显示菝葜组能改善结肠组织形态和组织学评分,减少单核细胞浸润、炎症细胞渗出,降低TNF-α、NF-κB 的表达(P<0.01),结果提示菝葜的抗炎作用机制可能是阻断TNF-α 的表达,抑制NF-κB的激活,而NF-κB 的抑制又减少TNF-α 的表达,从而阻断TNF-α 介导的炎症反应,最终起到抗炎的作用,阳性对照药强的松大剂量常常用于治疗UC,但大剂量容易引起糖尿病、类柯兴综合征,因此不能经常使用。菝葜组与强的松组在治疗UC 方面效果相当,且不会出现强的松的不良反应。

  综上所述,菝葜能有效减轻TNBS 诱导的UC,增强大鼠的活动能力,改善结肠病理改变。可能的机制是阻断TNF-α 的表达,抑制NF-κB 的激活,而NF-κB 的抑制又减少TNF-α 的表达,从而阻断TNF-α 介导的炎症反应,最终起到抗炎的作用。菝葜抗炎作用明确,毒副作用小,可能成为治疗UC 的良药。

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