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化学计量学及双标线性校正法应用于马钱子指纹图谱的讨论

作者:2017-01-23 14:01文章来源:未知
  马钱子为马钱科植物马钱( Strychnos nux-vomicaL. ) 的干燥成熟种子,主产印度、越南、泰国等,具有通络止痛,散结消肿的功效,用于跌打损伤,骨折肿痛,风湿顽痹,麻木瘫痪,痈疽疮毒,咽喉肿痛。由于其疗效卓越,为历代医家所推崇。马钱子含生物碱约2% ~5%,其中士的宁和马钱子碱占总生物碱的80% ~90%,是主要有效成分,也是有毒成分; 此外尚有环烯醚萜类成分如马钱苷酸和有机酸类的绿原酸等成分。由于中药成分复杂,指纹图谱已经成为中药质量评价和控制的常用手段。王月辉等采用HPLC 进行了马钱子指纹图谱的研究。本实验建立的指纹图谱进一步识别了马钱苷酸和绿原酸的色谱峰,并对数据进行了二维聚类分析和主成分分析。目前的指纹图谱研究多在单一色谱柱上进行,难以移植到其他色谱柱。或者用2 ~ 4 根色谱柱上的共有峰的相对保留时间均值进行色谱峰的定性,但预测的保留时间在不同色谱柱上的偏离较大,实用性不佳。本实验采用双标线性校正法来预测特征峰的保留时间,据此建立的马钱子指纹图谱可以较好地移植到不同的色谱柱上,既扩展了方法的适用范围又降低了对照品的使用成本。
  1 仪器与试药
  Waters e2695 高效液相色谱仪( 2998PDA 检测器) ; 柱1: Phenomenex Luna C18; 柱2: Dikma DiamonsilC18; 柱3: Kromasil 100-5 C18; 柱4: Agilent TC C18;柱5: Supelco Discovery C18; 柱6: GL Sciences IntersilODS-3; 柱7: Waters Symmetry C18; 柱8: Thermo BDSHypersil C18; 柱9: 资生堂Capcell pak C18 MG; 柱10:Shim-pack VP-ODS; 柱11: Kromasil Eternity-5 C18; 柱12: Agela Venusil MP C18( 柱5、6、10、12 的规格为4. 6 mm × 150 mm,5 μm,其余色谱柱规格为4. 6mm × 250 mm,5 μm) 。数据分析使用Chempattern化学计量学软件。马钱子样品1 号、2 号为国产栽培品,分别产自云南和海南,3至10 号样品为国内市场流通品,分别购自西藏、云南、新疆、甘肃、青海、贵州、内蒙古和四川。样品经中国食品药品检定研究院中药标本馆康帅药师鉴定,为马钱科植物马钱( Strychnos nuxvomicaL. ) 的干燥成熟种子。对照品马钱苷酸( 111865-201102) 、绿原酸( 110753-201314) 、士的宁( 110705-200306) 和马钱子碱( 110705-200306) 均来自于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂为分析纯。
  2 方法与结果
  2. 1 色谱条件
  色谱柱为柱1; 流动相: 水-醋酸-三乙胺( 240 ∶2. 4∶ 0. 3) 为A 相,乙腈为B 相。梯度洗脱( 0 ~ 20min: 98% A→88% A; 20 ~ 40 min: 88% A→90%A) ; 流速: 1. 0 mL·min - 1 ; 检测波长: 254 nm; 柱温:30 ℃; 进样量: 10 μL; 理论板数以士的宁峰计,不得少于15 000。
  2. 2 供试品溶液的制备
  取药材粉末( 过3 号筛) 0. 6 g,置具塞锥形瓶中,加甲醇-水-盐酸( 50∶ 50∶ 1) 混合溶液50 mL,称重,回流30 min,放冷后再称重并补重,摇匀,取续滤液,即得。
  2. 3 对照品溶液的制备
  取上述对照品适量,加甲醇制成每1 mL 含马钱子碱和士的宁各0. 1 mg 的溶液。
  2. 4 方法学考察
  2. 4. 1 精密度实验取上述对照品溶液,按“2. 1”项下方法,连续进样6 次,记录色谱图,考察仪器精密度。结果表明,士的宁峰保留时间的RSD 为0. 002%; 士的宁峰面积的RSD 为0. 01%。
  2. 4. 2 重复性实验取4 号药材粉末( 过3 号筛) 6份,每份约0. 6 g,精密称定,按“2. 2”项下制备供试品溶液,按“2. 1”项下方法进行测定,考察方法的重复性。结果表明,6份样品中各色谱峰相对保留时间的RSD在0. 04% ~0. 19%之间,各色谱峰相对峰面积的RSD在0. 82% ~2. 14%之间,表明重复性良好。
  2. 4. 3 稳定性实验取“2. 4. 2”项下的供试品溶液,按“2. 1”项下方法分别在0、4、8、24 h 进行测定,考察供试品溶液的稳定性。结果表明,各色谱峰相对保留时间的RSD 在0. 01% ~ 0. 09%之间,各色谱峰相对峰面积的RSD 在0. 31% ~ 1. 15%之间,结果表明供试品溶液的稳定性良好。
  2. 5 化学计量学分析马钱子指纹图谱
  2. 5. 1 马钱子指纹图谱共有模式将10 批马钱子药材的色谱图作为代表性图谱,选择所有样品中均存在的14 个峰为共有峰,采用均值法计算共有峰的峰面积,从而得到马钱子指纹图谱的共有模式。14 个色谱峰中,3、5、7 和8 号峰特别明显,作为指纹图谱的特征峰,其中3 号峰为马钱苷酸、5 号峰为绿原酸、7 号为士的宁、8 号为马钱子碱,经验证样品中4 个峰的保留时间、紫外光谱峰和质谱离子峰与相应的对照品一致。
  2. 5. 2 化学计量学分析先将10 批样品与共有模式比较,计算夹角余弦相似度,前2 批样品的相似度稍低( 相似度值分别为0. 953 3 和0. 886 5) ,后8 批马钱子的相似度均较高( 依次为0. 986 2、0. 998 4、0. 996 6、0. 997 1、0. 997 0、0. 996 1、0. 995 9 和0. 995 1) 。结果表明,马钱子所含主要成分的比例稳定,整体相似度很高,但也存在一定差异,根据样品来源,第1 和2 批为国内栽培品,其余为市场流通品,而流通品主要为进口马钱子,提示产地或为造成成分差异的主要因素。再进行二维聚类分析( 数据经标准化,采用近邻法,以欧氏距离计) 。其中, 为14 个色谱峰的结果,2个国产栽培品和3 号样品亲缘关系较近,其余的市场流通品聚为一类,这与样品的产地分类相吻合,3号有一定偏离,推测可能是国产马钱子。从图2A 的热图和纵向的成分聚类结果看,马钱子碱、马钱苷酸和士的宁的量较高,且在不同样品中的区别较明显,特别是马钱苷酸,因此选取这3 个成分和绿原酸重新进行二维聚类。图2B 的4 成分样品聚类结果与14 个成分的结果基本一致,说明这4 个成分已有很好的代表性和区别意义,最主要的区别点在于市场流通品的马钱苷酸和士的宁的峰面积比约为1∶ 2,而国产栽培品的比值约为1∶ 1。此外,还对标准化后数据进行了主成分分析,14个色谱峰的样品与载荷三维图见图3A,马钱苷酸等4 个色谱峰的相应三维图。两图的评价结果一致: 国产栽培品和市场流通品可以很好的区分,但3 号样品与其他市场流通品的空间距离稍显远,提示可能是国产马钱子; 这两类的主要区别为马钱苷酸,其中,国产栽培品的量更高。
  综上可知,相似度分析、聚类分析和主成分分析均能够对马钱子指纹图谱数据进行有效地评价,评价结果也基本一致。
  2. 6 双标线性校正法定性研究
  2. 6. 1 双标的选择和SRT 的计算本实验的色谱峰定性采用双标线性校正法,具体原理和方法见文献。首先在12 根不同的C18柱上采集马钱子指纹图谱,其中柱3 和柱10 因3、5 号峰重叠,柱8因3、5 号峰的出峰顺序颠倒,故以其余9 根色谱柱上4 个特征峰的保留时间进行计算相应成分的SRT( 标准保留时间,即同一成分在9 根柱上保留时间的均值) ,依次为马钱苷酸18. 144 min、绿原酸19. 382 min、士的宁25. 650 min、马钱子碱29. 432min。不同色谱柱上的拟合结果见图4,横坐标为4种成分的SRT,纵坐标为各色谱柱上对应的实测保留时间,可见成分在不同色谱柱上保留时间的线性关系良好。
  2. 6. 2 双标线性校正法与相对保留时间法的比较2 种保留时间预测方法在9 根色谱柱上的比较结果,见表1、2。相对保留时间法的预测以士的宁为参照物,均值为0. 707、0. 756 和1. 147。中最大绝对偏差为预测保留时间与实测保留时间的偏差;最大相对偏差为最大绝对偏差与实测保留时间的比值。由结果可见,双标线性校正法的预测精度更高,适用的色谱柱数量更多,明显优于相对保留时间法。
  3 讨论
  3. 1 本实验对氯仿、乙醚、碱性甲醇、酸性甲醇等不同提取溶剂和超声、静置以及回流等不同方法进行了比较,结果显示,酸性甲醇回流30 min 提取的供试品溶液,色谱峰多,组分含量高,信息较丰富。
  3. 2 相似度分析、聚类分析和主成分分析对马钱子指纹图谱数据的评价结果基本一致; 相似度分析的优点在于给出定量的数值,而二维聚类和主成分分析可以更直观地显示样本间的亲疏程度,此外还能够对变量降维并提示关键变量。
  3. 3 本实验曾比较了不同双标成分的保留时间预测结果,表明选择马钱苷酸和马钱子碱最优,符合已提出的双标选择原则,即尽量选择保留时间处于2 端的成分。
  3. 4 指纹图谱推广的关键是色谱标准化。色谱标准化受多种因素的影响,除仪器、色谱条件外,色谱柱的影响占主要因素。本实验考察了12 根不同品牌和型号的色谱柱,采用常用柱长( 250 和150mm) 、柱内径( 4. 6 mm) 、固定相类型( C18) 、粒径( 5μm) 并通过不同品牌及型号来综合考察端基是否封闭、填料的形状、填充的松紧度等因素对色谱的影响,下一步将增加色谱柱品牌及型号的数量,深入考察双标线性校正法的适用性。
  3. 5 上述分析均基于生马钱子,本实验未考虑炮制对各成分带来的影响,有待下一步的研究。
 

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