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关于抗菌肽AN5-2与大肠杆菌基因组DNA相互作用的光谱研究

作者:2017-06-03 18:04文章来源:未知
  抗生素在预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要作用,但随着多重耐药菌的出现以及耐药菌感染引发高死亡率,人们迫切需要新型的抗菌药物来解决这些问题。抗菌肽已被发现对细菌和真菌有广泛的抑菌效果,而且不易产生耐药性,有望成为新型安全、高效的抗菌药物。传统抗菌肽作用机制为膜破坏性机制和细胞内作用机制,基因组DNA为常见的抗菌肽细胞内作用靶点,抗菌肽与基因组DNA相互作用从而影响物质代谢和能量代谢来发挥抑菌活性。
  抗菌肽AN5-2(氨基酸序列:FCKSLPLPLSVK)是从枯草芽孢杆菌Paenibacillus alvei AN5发酵液中得到的一条抗菌肽,其具有较好的抗菌活性和稳定性;在以往的研究中,未对其与细菌基因组DNA的作用机理进行研究。我们采用光谱法研究抗菌肽AN5-2与大肠杆菌标准株基因组DNA 的相互作用,对抗菌肽AN5-2的抗菌作用机理进行初步研究。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  抗菌肽AN5-2由青岛贝泰克生物科技有限公司合成,纯度95%;大肠杆菌标准株(Escherichia coli ATCC 25922)由本实验室保存。溴化乙啶(EB),Luria-Bertani(LB)培养基和Mueller-Hinton(MH)培养基购自北京鼎国生物公司。PBS缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司,细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
  1.2 最低抑菌浓度MIC测定
  采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度(MIC)。将-80℃冰箱保存的大肠杆菌标准株涂布LB固体培养基平板,于37℃培养24h。挑取单克隆菌落接种MH 液体培养基,37℃,180rpm过夜振荡培养。用MH 培养基将过夜培养的菌液稀释到5×105 CFU/ml,按90μl/孔加入到96孔板中;将抗菌肽AN5-2从1mg/ml开始倍比稀释后,按10μl/孔加入到菌液中;然后于37℃,180rpm__________,培养24h;测定OD590nm,计算最低抑菌浓度MIC。
  1.3 抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互作用紫外光谱测定取500μl浓度为50μg/ml的基因组DNA溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液,抗菌肽溶液的浓度分别为10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml,37℃孵育30min后在岛津公司UV-2550紫外分光光度计上进行OD200nm-OD320nm 波长扫描测定反应体系紫外光谱,等体积无菌水做为对照。
  1.4 抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱测定取500μl浓度为500μg/ml的基因组DNA溶液(含1.5μg/ml溴化乙啶)加入等体积的抗菌肽AN5-2 溶液,37℃ 避光孵育10min。加入1ml不同浓度的肽溶液,肽溶液的浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml,37℃避光孵育30min。用岛津公司RF-5301PC 荧光分光光度计扫描反应液在OD550nm~OD750nm波长范围的荧光强度(激发波长λexcitation=535nm),等体积无菌水做为对照。
  1.5 抗菌肽AN5-2-基因组与DNA相互作用圆二色光谱测定将100μl浓度为0.5mg/ml的基因组DNA 溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液,抗菌肽溶液的浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml,混匀后使用日本分光株式会社JASCO-810圆二色光谱仪测定圆二色光谱。光谱扫描范围为OD220nm-OD320nm。等体积PBS缓冲液作为阴性对照。
  2 结果
  2.1 最低抑菌浓度MIC测定结果微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度为10μg/ml。
  2.2 抗菌肽AN5-2与基因组DNA结合的紫外光谱当抗菌肽AN5-2与大肠杆菌基因组DNA 以嵌插的方式作用时,紫外光谱出现减色效应,减色效应与插入作用的强弱呈正相关;当DNA 双螺旋结构破坏时则表现为增色效应。随着抗菌肽AN5-2浓度增加,基因组DNA的最大吸光值逐渐降低,说明抗菌肽可以与基因组DNA结合,由于抗菌肽AN5-2的插入引起DNA 碱基对的分开导致DNA 构象变化,但抗菌肽AN5-2未引起基因组DNA的断裂。
  2.3 抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱溴化乙啶(EB)在为一种嵌入型荧光染料,其在水溶液中荧光很弱;但当它通过嵌入方式与双链DNA 结合时,其荧光强度大幅度增强。如图2所示,实验结果表明EB-DNA复合体系的荧光强度随着抗菌肽AN5-2浓度的增加而不断降低,说明抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合大肠杆菌基因组DNA。
  2.4 抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互作用圆二色光谱在DNA 的圆二色光谱中,270nm 波长处的正峰是由碱基的堆积作用产生的。如图3所示,抗菌肽AN5-2与DNA相互作用后,正峰强度降低,说明抗菌肽AN5-2使DNA双螺旋结构变得松散,也削弱了DNA 碱基对之间的π-π堆积作用。但DNA的圆二色光谱峰位未发生变化,说明抗菌肽AN5-2的加入只影响了基因组DNA 二级结构,未引起双螺旋的解链。
  3 结论
  在以往的抗菌肽作用机理研究中,人们较多关注抗菌肽与细菌细胞膜的相互作用,并提出了“桶板模型”,“地毯模型”,“虫孔模型”等多种相互作用模型。但抗菌肽与细菌的其他细胞器,如线粒体、胞内蛋白和细胞骨架等的相互作用报道较少,特别是与细菌基因组DNA作用的报道更是少见。见诸报道的有抗菌肽PR-39可以作用于革兰氏阴性菌的DNA,抑制DNA的转录及翻译。乳铁多肽Lfcin作用于细菌DNA 后,引起细菌基因表达的改变。
  抗菌肽对细菌的胞内损伤是通过抑制细胞膜蛋白质的合成,干扰细菌的生理代谢等途径实现的。研究发现基因组DNA是抗菌肽的重要作用靶点,抗菌肽可以干扰基因复制、抑制转录的蛋白质合成。实验结果表明抗菌肽AN5-2杀菌的作用靶点是基因组DNA。抗菌肽AN5-2能够诱导DNA 结构变化,改变细菌DNA构象,双螺旋结构松散。基于实验结果,我们推断抗菌肽AN5-1首先通过静电作用和疏水作用与细菌细胞膜结合后进入细菌内部,与细菌基因组DNA 通过静电作用吸引靠近,再通过疏水作用、氢键作用等非共价作用嵌插如DNA双螺旋碱基对形成的疏水区域,使DNA链解链引发DNA结构发生变化,从而影响DNA的正常生理功能和细胞周期。
 

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