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简论磁纳米材料净化-超高效液相色谱-串联质谱测定猕猴桃中多农药残留

作者:2017-01-17 16:02文章来源:未知
  猕猴桃果实营养丰富,富含维生素C、多种矿物质元素(钾、钙、磷等)以及17种氨基酸,倍受人们喜爱。在猕猴桃生长过程中,为防止病虫害的发生、起到良好的丰收增产效果,不可避免会使用化学农药,由此带来的猕猴桃中农药残留问题同样值得重视。然而,目前针对猕猴桃中多农药残留分析的研究仍较少,已有的研究报道主要针对拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等农药,农药的覆盖面小;前处理方法以固相萃取和QuEChERS方法为主,结合气相色谱或液相色谱进行分析。固相萃取对样品的净化效果好,但操作过程相对繁琐,限制样品前处理速度。QuEChERS方法自2003年首次报道用于蔬菜、水果中农药多残留分析起,便以其操作简便、快速、价格低廉的优势得到广大分析工作者的青睐,成为农药残留分析的重要技术。但其净化过程中仍需要多步离心、涡旋等,成为限制批量样品处理速度的瓶颈。因此,本研究基于QuEChERS方法的优势,通过改良净化吸附剂达到提高样品前处理速度的目的;同时结合UPLC-MS/MS的精准分析优势,实现同时对多农药残留的快速测定。
  在净化吸附剂的选择上,磁性纳米材料因其具有与基体溶液快速分离的优势而成为理想的快速样品前处理材料,为农残分析提供了新的选择性净化策略。磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子具有超顺磁性、比表面积大、吸附位点多等特点,由于其价格便宜、低毒、合成简单而被广泛研究。然而Fe3O4的稳定性欠佳,易氧化且在极端酸、碱条件下不稳定。基于磁性Fe3O4表面羟基等功能基团进行功能化修饰后的磁性材料具有更高的实际应用价值。目前已有采用C18、石墨烯等修饰的磁性Fe3O4功能材料应用于农药分析中的报道。这些研究大都基于目标化合物与磁性材料形成相互作用力原理而实现富集或净化,吸附过程具有选择性,需要经解吸附与浓缩后再分析。然而吸附材料的覆盖面相对于农药种类而言仍然有限,从而限制了纳米材料在农药分析中的应用。
  本研究基于杂质去除模式,针对猕猴桃中存在的干扰源(有机酸、脂肪酸等),选取Fe3O4-PSA(N-丙基乙二胺修饰的四氧化三铁)作为净化吸附剂;针对猕猴桃中非极性干扰物,选取已广泛商品化的C18材料作为辅助净化吸附剂,使用UPLC-MS/MS实现多农药残留的快速分析、测定。
  1实验部分
  1.1仪器与试剂
  LC-30A超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)和AB-SCIEX4500三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)。Masslynx4.1软件(美国AB公司)用于仪器控制、数据采集和结果分析。色谱柱为InertsilODS-3色谱柱(75mm×2.1mm,2μm,日本GLSciences公司);FilterUnit滤膜(0.22μm,天津AgelaTechnologies公司)。
  分析标准品购于上海农药研究所或农业部环境保护科研监测所,主要包括52种农药及8种相关农药代谢物,分别为:乙酰甲胺磷(acephate)、啶虫脒(acetamiprid)、嘧菌酯(azoxystrobin)、甲萘威(carbaryl)、多菌灵(carbendazim)、乐果(dime-thoate)、烯酰吗啉(dimethomorph)、吡虫啉(imidacloprid)、马拉硫磷(malathion)、甲胺磷(methamidophos)、氧乐果(omethoate)、伏杀硫磷(phosalone)、辛硫磷(phoxim)、咪鲜胺(pro-chloraz)、哒螨灵(pyridaben)、嘧霉胺(pyrimetha-nil)、噻虫嗪(thiamethoxam)、敌敌畏(dichlor-vos)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinben-zoate)、灭幼脲(chlorbenzuron)、除虫脲(difluben-zuron)、阿维菌素(abamectin)、三唑酮(triazolone)、二嗪磷(diazinon)、甲基异柳磷(isofenphos-methyl)、水胺硫磷(isocarbophos)、丙溴磷(profenofos)、亚胺硫磷(phosmet)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、噻嗪酮(buprofezin)、氯吡脲(forchlorfenuron)、戊唑醇(tebuconazole)、抗蚜威(pirimicarb)、异丙威(isoprocarb)、噻螨酮(hexythiarizonaox)、喹硫磷(quinalphos)、久效磷(moncrotophos)、倍硫磷(fenthion)、敌百虫(tri-chlorphon)、腈菌唑(myclobutanil)、多杀菌素(spi-nosad)、鱼藤酮(rotenone)、莠去津(atrazine)、茚虫威(indoxacarb)、丙环唑(propiconazole)、三唑醇(triadimenol)、氟啶脲(chlorfluazuron)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、克百威(carbofuran)及其代谢物3-羟基克百威(3-hydroxy-carbofuran)、涕灭威(aldicarb)及其代谢物涕灭威砜(aldicarbsulfone)和涕灭威亚砜(aldicarbsulfoxide)、甲拌磷(phorate)及其代谢物甲拌磷砜(phoratesulfone)和甲拌磷亚砜(phoratesulfoxide)、氟虫腈(fipro-nil)及其代谢物氟虫腈砜(fipronilsulfone)、氟虫腈亚砜(fipronilsulfide)和氟甲腈(fipronildesulfi-nyl)。
  Fe3O4-PSA为实验室自制,详细制备过程参见文献。商品化的PSA(40~60μm)、C18(50μm)均购于天津AgelaTechnologies公司。甲醇、乙腈(色谱纯)购于美国Merck公司;甲酸铵(HPLC级)购于美国Tedia公司;NaCl、无水MgSO4等其他试剂均为国产分析纯。实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统,美国Millipore公司)。
  1.2实验方法
  1.2.1样品前处理
  萃取过程:称取10.00g(±0.05g)猕猴桃于50mL离心管中,准确加入10mL乙腈,涡旋1min。加入1.5gNaCl和4.0g无水MgSO4,涡旋1min,以7000r/min的转速离心3min,取上清液净化。
  磁性净化吸附剂净化过程:准确移取1mL乙腈萃取的上清液到含有20mgFe3O4-PSA、30mgC18和0.15g无水MgSO4的2mL离心管中,剧烈振荡1min后,置于长方体磁铁侧面2~3s即可完全分离。准确吸取上清液0.5mL至装有0.5mL水的2mL离心管中,混匀,用0.22μm滤膜过滤,待UPLC-MS/MS分析。
  非磁性净化吸附剂净化过程:准确移取乙腈萃取上清液1mL到含有40mgPSA、50mgC18和0.15g无水MgSO4的2mL离心管中,剧烈振荡后涡旋1min,在7000r/min的转速下离心3min。准确吸取上清液0.5mL至装有0.5mL水的2mL离心管中,混匀,用0.22μm滤膜过滤,待UPLC-MS/MS分析。
  1.2.2UPLC-MS/MS分析
  采用UPLC-MS/MS对猕猴桃中多农药残留进行分析测定。色谱柱为InertsilODS-3色谱柱,柱温为40℃,进样量为2μL。流动相A:5mmol/L甲酸铵水溶液;流动相B:5mmol/L甲酸铵甲醇溶液;等度洗脱:10%A,90%B;流速为0.25mL/min。质谱条件:采用电喷雾离子源,多反应监测(MRM)模式;加热温度为450℃;喷雾电压为+5500V和-4500V。每个化合物由两对母离子-子离子对共同确定,各化合物的母离子-子离子对及相应的碰撞能量和去簇电压。
  1.2.3统计分析
  利用SPSS16.0软件进行主成分分析,评价净化剂用量对目标化合物回收率变化趋势的影响,筛选最佳净化吸附剂用量条件。
  2结果与讨论
  2.1净化吸附剂的优化
  2.1.1Fe3O4-PSA用量对农药回收率的影响
  Fe3O4-PSA磁性材料中起主要净化作用的PSA基团具有弱阴离子交换功能,能够与基质中有机酸、糖类等分子中的羟基形成非共价键而去除这类杂质。为降低方法的耗材成本,需在保证其净化效果的情况下,尽可能减少吸附剂的用量,需要通过优化其用量达到两者间的平衡。方法优化过程中以回收率作为主要评价指标,在空白猕猴桃样品的乙腈提取液中加入混合农药标准溶液,使提取液中各农药质量浓度均为0.1mg/L。准确移取1mL上清液至预装有0.15g无水硫酸镁和不同量Fe3O4-PSA(0、10、20、30和40mg)的2mL离心管中,样品经净化、磁分离后采用UPLC-MS/MS分析。部分农药(如氧乐果、敌百虫、甲氰菊酯等)在不同Fe3O4-PSA用量下的回收率。在不使用净化吸附剂的情况下,目标化合物的回收率偏高,如敌百虫、氧乐果的回收率分别高达173%和199%;使用净化吸附剂Fe3O4-PSA可使农药回收率保持在83.7%~124%,这可能是由于Fe3O4-PSA通过去除基体杂质而提高了分析的准确度。为提高分析精密度,目标化合物的回收率范围缩小至80%~110%时,20和40mgFe3O4-PSA可满足需求。综合考虑方法的经济性,选择20mgFe3O4-PSA进行净化。
  2.1.2C18用量对农药回收率的影响
  C18是QuEChERS方法常用的净化剂,C18容易吸附非极性物质(如脂肪、甾醇、挥发油等),添加C18作为辅助净化剂可以有效去除该部分杂质;但它同时也会吸附非极性农药或碳链较长的农药,进而降低目标化合物的回收率,因而需探索C18用量对农药回收率和净化效果的影响。实验优化过程参照2.1.1节,净化吸附剂为0.15g无水硫酸镁、20mgFe3O4-PSA和不同用量的C18(10、20、30和40mg)。在该净化过程中,各吸附剂充分混匀,在无外界磁场干扰条件下可以充分分散,起到吸附杂质的目的;在外加磁场作用下,Fe3O4-PSA可以包裹其他吸附剂在磁场作用下聚集,快速实现分离。可知,随着C18用量的增大,涕灭威亚砜和氯吡脲的回收率呈现下降趋势;克百威的回收率在C18用量为40mg时已高达139%,显著增大。当C18用量为30mg时各化合物的回收率为94.6%~109%,可以很好地满足分析需求,因此确定C18吸附剂的用量为30mg。同时,将未净化的样品与经20mgFe3O4-PSA和30mgC18净化的样品溶液进行对比,可以明显看出未净化样品呈淡黄色浑浊状,而经过该方法净化后的样品已接近于无色透明状态。
  2.2方法验证
  2.2.1线性范围及检出限
  配制制作溶剂标准曲线及基质标准曲线的标准溶液。其中溶剂标准曲线的标准溶液用甲醇-水(1∶1,v/v)溶液配制,基质标准曲线的标准溶液用空白基质乙腈提取液-水(1∶1,v/v)配制,目标化合物质量浓度梯度均为2、5、10、25、50、100和250μg/L,经UPLC-MS/MS分析后,以色谱峰面积(Y)对质量浓度(X,μg/L)进行线性回归,得到回归方程和相关系数。结果显示,60种目标化合物在2~250μg/L范围内具有良好的线性关系。检出限(LOD)为3倍信噪比所对应的化合物质量浓度,本方法中52种农药及8种相关农药代谢物的LOD值为0.11~2.05μg/L。欧盟文件SANCO/12571/2013规定定量限(LOQ)为实验中最低添加浓度水平,且回收率必须满足实验工作需求。本试验的最低添加水平为10μg/kg,各农药的回收率为76.0%~121%,故本方法中52种农药及8种相关农药代谢物的LOQ为10μg/kg。
  2.2.2基质效应评价
  基质效应是通过基质标准曲线线性方程斜率和溶剂标准曲线线性方程斜率比来评价的。如果斜率比为1,说明没有基质效应;如果斜率比小于1,呈基质抑制效应;如果斜率比大于1,呈基质增强效应。噻嗪酮(4.15)、三唑醇(65.51)呈现明显基质增强效应;乙酰甲胺磷(0.09)、啶虫脒(0.14)、氧乐果(0.09)、甲胺磷(0.09)、久效磷(0.15)、乐果(0.15)存在明显的基质抑制效应;辛硫磷、咪鲜胺、抗蚜威等34种化合物的斜率比在0.8~1.01范围内,说明基质效应对这些农药的定量分析影响相对较低。为了兼顾所有农药并实现准确定量,仍采用基质标准曲线进行校正。
  2.2.3回收率及精密度
  使用空白猕猴桃基质进行添加回收率试验,添加水平为10、100和200μg/kg(每个添加水平平行测定3次),按照本方法进行试验。52种农药及8种相关农药代谢物在不同添加水平下平均回收率为76.0%~121%,RSDs为0.1%~13.8%。方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求。
  2.2.4与非磁性净化吸附剂的对比
  为验证本方法的适应性及快捷性,将本方法与使用非磁性净化吸附剂的QuEChERS方法进行对比。在后一方法中,选用商品化的PSA和C18为净化吸附剂,并对其用量条件进行了优化。
  采用本方法和以非磁性材料为净化吸附剂的QuEChERS方法同时分析60个猕猴桃样品,对样品中目标化合物的回收率分布、净化吸附剂用量及样品分析时间进行对比。在添加水平为100μg/kg时,本方法中81%的药物回收率集中在80%~100%,而非磁性净化剂的方法中70%的药物回收率处于该范围。在净化吸附剂的用量上,本方法中磁性净化吸附剂及其辅助净化吸附剂C18的用量均低于非磁性净化吸附剂净化方法的使用量。在样品处理速度上,本方法在140min内即可完成全部样品萃取和净化,而选用非磁性材料为净化吸附剂时需要200min,本方法大大节约了样品前处理时间。
  3结论
  本研究利用磁性纳米材料Fe3O4-PSA磁分离和净化的优势与UPLC-MS/MS定量分析的优势,建立了同时对猕猴桃中52种农药及相关农药代谢物进行快速分析的方法。该磁性材料具有良好的超顺磁性,在外加磁场的作用下可以快速实现磁性材料与样品溶液的分离,不需再进行离心或过滤等处理,使分离过程更简单、快速。整个前处理过程更加方便、省时,短时间内可以实现样品的高通量处理。在优化的净化吸附剂用量条件下,Fe3O4-PSA和C18的组合净化效果明显优于PSA和C18的组合净化效果。该方法为猕猴桃中多农药残留快速检测提供了新的方法依据。在下一步的研究中,希望通过改进磁分离配套实验设备等方式进一步提升样品前处理效率,为我国农产品质量安全监管工作提供了技术支撑。
 

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